Na 25 dagen statische incubatie bij 28 °C vertoonde laccase van *Pleurotus ostreatus* NRC620 de hoogste activiteit in het schimmelkweekmedium. De optimale pH- en temperatuurwaarden voor dit enzym waren respectievelijk 3,0 en 70 °C. Na 2 uur incubatie bij 40 °C en 50 °C bleef de enzymactiviteit respectievelijk 68,33% en 59,61% behouden. Na 2 uur incubatie in citraat-fosfaatbuffer (pH 7,0) bleef de enzymactiviteit 100%. De toevoeging van 10 mM MgSO₄ en CuSO₄ verhoogde de enzymactiviteit met respectievelijk ongeveer 21% en 35%, terwijl NaCl, MnCl₂, KCl en CaCl₂ de enzymactiviteit remden. Met ABTS als substraat werden de kinetische parameters (Km en Vmax) van *Pleurotus ostreatus* NRC 620 laccase respectievelijk 1,99 mM en 16.217 μmol min−1 L−1. Enzymatische behandeling van appelsapmonsters verminderde zowel de pH als de viscositeit aanzienlijk, en deze vermindering correleerde met een langere bewaartijd. Laccasebehandeling resulteerde in een lichte afname van het totale fenolgehalte van het appelsap, maar er werd geen vermindering van de antioxidantactiviteit waargenomen.
De laatste jaren hebben onderzoekers zich gericht op de toepassing van groene biotechnologie in de voedingsmiddelenindustrie. Laccase is een van de meest nuttige enzymen in de voedingsmiddelenindustrie en vindt toepassingen in onder andere sapverwerking, bakken, wijnstabilisatie en het verbeteren van de organoleptische eigenschappen van voedingsproducten.1Veel hogere planten en micro-organismen scheiden laccase af.2En schimmels zoals deuteromyceten, ascomyceten en basidiomyceten kunnen ook laccase produceren.3Laccase (EC 1.10.3.2) is een blauwoxidase die moleculaire zuurstof reduceert tot water met behulp van een systeem bestaande uit drie verschillende koperatomen, waardoor diverse fenolische verbindingen en aromatische aminen worden geoxideerd. Tijdens de productie van fruit- en groentesappen zijn enzymatische en niet-enzymatische bruining kritieke problemen.4Omdat deze stoffen een negatieve invloed hebben op de kleur, smaak en geur van het sap, moeten ze worden verwijderd.5
Van alle fruitsoorten worden appels wereldwijd en in de Europese Unie het meest geconsumeerd. In 2019 stond de appelproductie wereldwijd op de derde plaats, met meer dan 87 miljoen ton.6Appels bevatten talrijke fenolische verbindingen, waaronder flavonoïden en fenolzuren zoals cafeïnezuur en chlorogeenzuur.7Omdat appelsap doorgaans helder wordt geconsumeerd, gaat ongeveer 50% tot 90% van de fenolische bestanddelen verloren tijdens het filtratieproces.8Tegenwoordig kiezen consumenten vaak voor minimaal bewerkte producten, zoals troebel appelsap met een hoog polyfenolgehalte. Door dit hoge fenolgehalte is dit type appelsap echter bijzonder gevoelig voor verkleuring en donker worden.9Er worden diverse technologieën gebruikt, waaronder warmtebehandelingsmethoden zoals pasteurisatie bij 60-90 °C, om het donkerder worden van appelsap te verminderen of te voorkomen.10Dat blijkt echter uit onderzoek van Sauceda-Gálvez11Thermische verwerking kan vluchtige chemicaliën vernietigen en de organoleptische eigenschappen van appelsap aantasten. Alternatieven voor thermische verwerkingsmethoden zijn onder andere superkritisch kooldioxide, ultraviolette straling, ultrageluid, hoge hydrostatische druk of hogedrukhomogenisatie.12De efficiëntie van deze technologieën en de opbrengst van geschikte vruchtensappen hangen af van de gebruikte parameters en productkenmerken. Het wijdverbreide gebruik ervan wordt beperkt door hoge kosten, nadelige effecten op de kwaliteit van sommige voedingsproducten of onvoldoende enzyminactivering.13,14
Laccase kan worden gebruikt om vruchtensap te stabiliseren en te klaren.15Gökmen et al.16Het gebruik van laccase wordt aanbevolen voor het klaren van vruchtensap, omdat het fenolische verbindingen effectief verwijdert door ze om te zetten in polymeren of oligomeren die gemakkelijk door elk ultrafiltratiemembraan kunnen worden verwijderd. Hierdoor behoudt appelsap tot wel zes weken een stabiele kleur en helderheid bij 50 °C. Gezuiverde *Trichoderma*-laccase werd geïmmobiliseerd op aluminiumoxidekorrels en gebruikt om selectief ongewenste smaakstoffen te verwijderen die worden veroorzaakt door microbiële verontreiniging van appelsap.17
Ongeveer 80-90% van de vluchtige bestanddelen van appelsap bestaat uit esters en aldehyden, die het sap een uniek aroma geven.18Laccase van *Trametes versicolor* werd geïmmobiliseerd op een goedkope drager gemaakt van natuurlijke vezels uit jonge kokosnootschalen voor het klaren van appelsap.19Eerdere studies hebben de stabilisatie van appelsap (kleur en troebelheid) onderzocht met behulp van enzymvrije methoden, immobilisatiemethoden of een combinatie daarvan met ultrafiltratie.5,19Het effect van schimmellaccasen op de fysisch-chemische eigenschappen van appelsap tijdens opslag is echter nog onduidelijk. Daarom was het doel van deze studie om experimenteel de veranderingen in de fysisch-chemische eigenschappen, het gehalte aan fenolverbindingen en de antioxidantactiviteit van appelsap te onderzoeken na behandeling met schimmellaccasen en twee weken gekoelde opslag. Laccasen hebben het vermogen om fenolverbindingen te oxideren, waardoor ze veelbelovend zijn voor gebruik in diverse industriële processen, waaronder sapklaring. Deze studie onderzocht laccasen van *Pleurotus ostreatus* NRC 620, met de focus op de ideale omstandigheden voor hun activiteit en effectiviteit bij sapklaring. Hoewel onderzoek naar oesterzwammen (P. ostreatus NRC 620) nog beperkt is, hebben eerdere studies enzymen van verschillende schimmelbronnen onderzocht, zoals Trametes versicolor en Ganoderma lucidum. Het doel van deze studie was om de potentiële toepassing van dit enzym in de voedingsmiddelenindustrie te evalueren en de unieke eigenschappen ervan te belichten, met name de ideale pH en temperatuur.
2,2′-Azooxybis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur) (ABTS) werd gekocht bij Sigma-Aldrich (Canada). Alle overige reagentia waren van analytische kwaliteit.
Het Microbiële Cultuurcollectiecentrum van het Nationaal Onderzoekscentrum verkreeg de bekende oesterzwamstam NRC620. Na subcultivering werd deze stam bewaard op aardappel-dextrose-agarhellingen bij 4 °C. De bereidingswijze van het inoculum was als volgt: 10 dagen oud, volledig ontwikkeld mycelium werd geënt op aardappel-dextrose-agarplaten en geïncubeerd bij 28 °C. Na 10 dagen werden drie myceliumblokjes met een diameter van 12 mm uit de agarplaten verwijderd met behulp van een steriele metalen pons en in Erlenmeyerflessen van 250 ml geplaatst met wattenpropjes, gevuld met 50 ml gesteriliseerd kweekmedium (pH 5,0, zoals eerder beschreven door Othman et al.).20De culturen werden gedurende 18 dagen bij 28 °C geïncubeerd. Vervolgens werden de culturen gefilterd door Whatman nr. 1 filterpapier en diende het resulterende supernatant als enzymbron.
De laccase-activiteit werd bepaald met ABTS als substraat. Het reactiemengsel (2 ml) bevatte 500 μl 0,3 mM ABTS (opgelost in 0,1 M natriumcitraatbuffer, pH 4,5) en de benodigde hoeveelheid enzymmonster verdund met gedestilleerd water.21,22Aangezien laccase ABTS bij kamertemperatuur (28 °C ± 2) kan oxideren, werd de ABTS-oxidatie bepaald door de toename in absorptie bij 420 nm (ε) te meten.420= 36.000 cm-1 M -1) met behulp van een Agilent Carry-100 UV-spectrofotometer. Eén eenheid laccase-activiteit was nodig om 1 μmol ABTS per minuut te oxideren. De eiwitconcentratie werd bepaald met de Bradford-methode, waarbij bovine serumalbumine als interne controle werd gebruikt.23,24
Nadat het enzym uit de oesterzwamstam NRC 620 was verkregen, werd de activiteit ervan gedurende 25 dagen bij verschillende kweekintervallen gemeten onder statische omstandigheden bij 28 °C.
Om het effect van temperatuur op de laccase-activiteit te bestuderen, werden experimenten uitgevoerd bij temperaturen tussen 20 en 90 °C. Voordat het enzym werd toegevoegd en de reactie werd gestart, werden de buffer (0,1 M natriumcitraat, pH 4,5) en het substraat (ABTS) gemengd en gedurende 5 minuten bij verschillende temperaturen geïncubeerd. De thermische stabiliteit van het enzym werd beoordeeld door incubatie in 0,05 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,0) bij respectievelijk 40, 50, 60 en 70 °C gedurende 2 uur. De resterende activiteit werd vervolgens bepaald met behulp van het ABTS-substraat.
Het effect van pH op de laccase-activiteit werd onderzocht met ABTS als substraat in 0,1 M citraat-fosfaatbuffers met een pH-bereik van 2,5 tot 7,0. De enzymoplossing werd gedurende twee uur bij 40 °C geïncubeerd in 0,1 M citraat- en Tris-buffers (pH 3, 4, 6 en 7) om de pH-stabiliteit te bepalen. De resterende activiteit met ABTS als substraat werd na incubatie berekend.
De laccase werd gedurende 10 minuten geïncubeerd in natriumfosfaatbuffer (0,05 M, pH 7,0) met verschillende metaalionen (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ en Mn2+) in concentraties van respectievelijk 2,5 mM en 10 mM. Vervolgens werd het substraat (ABTS) toegevoegd om de reactie te starten en werd de relatieve activiteit bepaald.
De oxidatie van ABTS door laccase bij verschillende concentraties (0,025–3 mM) werd gemeten bij pH 4,5 om de kinetische parameters (Vmax en Km) te bepalen. De kinetischeconstantenDe kinetische constanten van de Michaelis-Menten-vergelijking werden berekend met behulp van een Lineweaver-Burk-grafiek, die de reciproque waarde van de reactiesnelheid uitzet als functie van de substraatconcentratie. De kinetische constanten werden berekend uit de Lineweaver-Burk-grafiek met behulp van GraphPad Prism versie 6.01 software.
Na de appels grondig te hebben gewassen met kraanwater, werden ze doormidden gesneden en geperst met een volautomatische Braun MP80 appelpers (gemaakt in Duitsland). Het sap werd gefilterd door vier lagen kaasdoek. Aan de controlegroep werden geen enzymen toegevoegd, terwijl aan vers geperst appelsap 2,0% laccase (de meest effectieve concentratie die werd getest) werd toegevoegd. Dit sap werd vervolgens twee weken bewaard bij 4 °C.
De titreerbare zuurgraad (TA) en de pH werden bepaald volgens de methode van Boulton et al.al.27De pH van elk monster werd gemeten met een digitale pH-meter (JENWAY 3510 pH-meter). De titreerbare zuurgraad (TA) werd berekend op basis van appelzuur met behulp van de volgende formule.
Waarbij V en C respectievelijk het volume (mL) en de concentratie (0,1 mol/L) van de natriumhydroxideoplossing zijn die bij de titratie is gebruikt. K is de omzettingscoëfficiënt van appelzuur, gelijk aan 0,067, en W is de massa (g) van het appelsap.
De totale hoeveelheid oplosbare vaste stoffen (TDSHet gehalte van alle sapmonsters werd bepaald met behulp van een PAL-1 zakrefractometer (ATAGO, Tokio, Japan). Na elke meting werd de optische lens gespoeld met gedemineraliseerd water en werd elk appelsapmonster driemaal getest. De waarde voor elk monster werd berekend door het gemiddelde van de drie metingen te nemen. Het gemiddelde ± standaardafwijking voor elk appelsapmonster werd eveneens berekend door het gemiddelde van deze resultaten te nemen.
De visco-elasticiteit van de appelsapmonsters werd bepaald met behulp van een rotatieviscometer (RV, Rheotest 2, Duitsland). Het monster werd in de "S2"-cilinder van de viscometer geplaatst. De schijnbare viscositeit werd weergegeven door de helling van de schuifspanning-versus-schuifsnelheidcurve, die werd berekend uit de schuifspanning en de bijbehorende curven bij verschillende schuifsnelheden (van 1,00 tot 437,4 s⁻¹). De formule voor het berekenen van de schijnbare viscositeit is als volgt:
Waarbij η de schijnbare viscositeit (cP) is, τ de schuifspanning (dyn/cm²), γ de schuifsnelheid (sec⁻¹), en (τ) wordt berekend met behulp van de koppel (α) en cilinder (Z) waarden met de volgende formule: τ = Z . α.
De bruiningsindex werd bepaald volgens de methode van Meidav etal.29Een sapmonster van 10 ml werd gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 2750 xg. 5 ml van het sapsupernatant werd gemengd met 5 ml 95% ethanol. De absorptie van het mengsel werd gemeten bij 420 nm met behulp van een Shimadzu UV-spectrofotometer (UV-1601 PC).
Het totale fenolgehalte (TPC) werd colorimetrisch bepaald met behulp van het Folin-Ciocalteu-reagens, zoals beschreven door Boulton et al.[27Er werd een standaardcurve voor galluszuur geconstrueerd voor concentraties van 0 tot 500 mg/L (r²= 0,997). De resultaten worden uitgedrukt als galluszuurequivalenten (mg GAE/mL).
Voeg 125 μL gedestilleerd water en 2850 μL FRAP-oplossing toe aan 25 μL appelsap en laat het mengsel in het donker staan.30min. Meet vervolgens de absorptie bij 593 nm met behulp van een Shimadzu UV-spectrofotometer (UV-1601 PC). Het FRAP-reagens werd bereid door 300 mM acetaatbuffer (pH 3,6), 20 mM ijzer(III)chloride en 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)triazine (TPTZ) (opgelost in 40 mM HCl) te mengen in een verhouding van 10:1:1. Er werd een standaardcurve gegenereerd met Trolox als standaard (R²= 0,999), en de resultaten worden uitgedrukt als μM Trolox/mL.
De antioxidantwerking van de behandelde en onbehandelde sappen werd bepaald met behulp van de DPPH-methode om hun vermogen om DPPH-vrije radicalen te neutraliseren te evalueren.31Tien microliter sap werd gemengd met 1 ml van een DPPH-oplossing (100 μM) in methanol. Na een reactie van 30 minuten in het donker werd de absorptie van het mengsel gemeten bij 517 nm met behulp van een Shimadzu UV-spectrofotometer (UV-1601 PC). De resultaten werden uitgedrukt als trolox-equivalenten (μM trolox/ml) op basis van een kalibratiecurve.R2= 0,990).
De verkregen gegevens toonden aan dat de maximale laccaseproductie in NRC 620 oesterzwammen werd waargenomen aan het einde van de 18e fermentatiedag, met een activiteit van 1302 U/L. Dit diende als basis voor het bepalen van de optimale kweekduur voor laccaseproductie (Figuur 1). Hoewel de enzymproductie toenam met een langere kweekduur, was de mate van toename niet rechtstreeks evenredig met de kweekduur; na 21 dagen was de enzymactiviteit slechts met 90 U/L toegenomen (tot 1390 U/L). Daarom werd uiteindelijk 18 dagen gekozen als de optimale kweekduur om de productopbrengst in evenwicht te brengen met de economische voordelen van een langere kweekduur.
Effect van de kweekduur op de laccase-opbrengst in Pleurotus ostreatus NRC 620. Drie (12 mm) schimmelmyceliumblokjes werden geënt in 50 ml steriel medium en vervolgens gedurende verschillende tijden gekweekt bij 28 °C.
In overeenstemming met andere studies wijzen onze resultaten erop dat de ideale kweekperiode voor het bereiken van een piek in de laccase-secretie door schimmels waarschijnlijk tussen de 7 en 36 dagen ligt.32Volgens Ezike et al.33*Trametes polyzona* WRF03 produceerde de hoogste hoeveelheid laccase aan het einde van de negende dag van de fermentatie, met een specifieke activiteit van 1637 U/mg eiwit. Bovendien hebben Othman et al.34Uit onderzoek bleek dat *Trichoderma harzianum* S7113 op de vijfde dag van de kweek een grote hoeveelheid laccase afscheidde. De laccaseproductie bereikte een piek op de veertiende dag en nam daarna geleidelijk af.34Hoewel enzymsecretie ook tijdens de belangrijkste groeifase kan plaatsvinden, bereikt deze meestal een piek tijdens de tussenfase en wordt ze geactiveerd door de consumptie van een koolstof- of stikstofbron.34,35
Hoewel laccase van Pleurotus ostreatus NRC 620 een hoge activiteit vertoonde over een breed temperatuurbereik van 50°C tot 80°C, waarbij de activiteit de piek benaderde (69-98%), werd de maximale activiteit waargenomen bij 70°C (Fig. 2a). Buiten dit temperatuurbereik nam de enzymactiviteit af bij ongeveer 70°C. Deze resultaten suggereren dat het enzym actief is bij hoge temperaturen, waarschijnlijk omdat een hoge temperatuur de kinetische energie van de reactie verhoogt.
Effect van reactietemperatuur (a) en pH (b) op de laccase-activiteit in *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperaturen variërend van 20 tot 90 °C werden bereikt door het mengsel 5 minuten voor te incuberen bij verschillende temperaturen alvorens het enzym toe te voegen en de reactie te starten. Het effect van pH op de laccase-activiteit werd beoordeeld met behulp van ABTS als substraat in oplossingen die 0,1 M citraat-fosfaatbuffer bevatten, over een pH-bereik van 2,5 tot 7,0.
Volgens Ezike etal.33De optimale temperatuur voor *Trametes polyzona* WRF03 laccase is 55 °C, wat hetzelfde is als die voor *Ganoderma lucidum*.laccase36en vergelijkbaar met de optimale temperatuur (50 °C) voor *Trametes polyzona* KU-RNW02737laccase . Baldrian38merkt op dat, net als bij andere lignine-afbrekende enzymsystemen, het ideale temperatuurbereik voor laccase tussen de 50 en 70 °C ligt.
De resultaten toonden aan dat het enzym de hoogste activiteit vertoonde bij pH 3,0, met een activiteit van 94% bij pH 3,5. Het bleef echter actief over een breed pH-bereik van 2,5 tot 7,0 (Figuur 2b). Bovendien vertoonde het een hogere activiteit onder zure omstandigheden vergeleken met neutrale of alkalische omstandigheden. De activiteit bleef minstens 77% over het pH-bereik van 2,5 tot 4,5, maar bereikte slechts ongeveer 38% bij pH 7,0. De optimale pH voor laccase van *Trametes polyzona* WRF03 was 4,533, wat gelijk is aan de pH voor laccases van *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 en *Trametes hirsuta* 41. Volgens de studie van Chairin et al.42De optimale pH voor laccase van *Polymorpha f. sp.* WR710-1 is 2,2, terwijl de optimale pH voor laccase van *Polymorpha f. sp.* IBL-04 5,043 is. De binding van hydroxide-anionen (laccase-remmer) aan de koperatomen van T2/T3-laccase kan de reden zijn voor de verminderde laccase-activiteit onder neutrale of alkalische pH-omstandigheden. Dit kan de interne elektronenoverdracht van het T1-centrum naar het T2/T3-centrum verstoren, waardoorbeperkendde enzymactiviteit23,44
Door het enzym bij verschillende temperaturen te incuberen, werd vastgesteld dat zowel de incubatietijd als de temperatuur de enzymstabiliteit beïnvloedden. Met name laccase van *Trametes polyzona* NRC 620 vertoonde een hogere stabiliteit bij 40℃ en 50℃, waarbij respectievelijk 68,33% en 59,61% van de initiële activiteit behouden bleef na 120 minuten (Figuur 3a). Daarentegen behield laccase van *Trametes polyzona* WRF03 onder dezelfde omstandigheden (40℃ en 50℃, 120 minuten) respectievelijk 64,38% en 42,92% van de activiteit.33Integendeel, een langere incubatietijd en hogere temperatuur verminderden de stabiliteit van de laccase van *Trametes polyzona* NRC 620; na incubatie bij 60℃ en 70℃ gedurende 60 minuten daalde de activiteit tot respectievelijk 39,24% en 1,72% (Figuur 3a). In overeenstemming met de experimentele resultaten vertoonde de laccase van *Trametes polyzona* WRF03 een hogere stabiliteit bij 40 en 50℃ gedurende het gehele thermische behandelingsproces.33Op dezelfde manier hebben Lueangjaroenkit enal.37en Chairin etal.42Er werd gerapporteerd over de stabiliteit van laccasen van respectievelijk Trametes polyzona KURNW027 en Trametes polyzona WR710-1 bij 50 °C gedurende 1 uur. Als nuttige biocatalysator, toepasbaar in diverse biotechnologische gebieden, dient laccase een goede stabiliteit en prestatie te hebben over een breed temperatuurbereik.
Thermostatische stabiliteit (a) en pH-stabiliteit (b) van laccase van *Pleurotus ostreatus* NRC 620. De thermostatische stabiliteit werd beoordeeld door de enzymoplossing gedurende 2 uur te incuberen in 0,05 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,0) bij respectievelijk 40, 50, 60 en 70 °C. De pH-stabiliteit werd beoordeeld door de enzymoplossing gedurende 2 uur te incuberen in 0,1 M citraatbuffer en Tris-buffer (pH 3, 4, 6 en 7) bij 40 °C. De resterende activiteit werd berekend met ABTS als substraat na incubatie.
Om de optimale omstandigheden voor het gebruik en de opslag van het enzym te bepalen, onderzochten we het effect van de pH op de stabiliteit van laccase. Blootstelling aan verschillende pH-waarden had een significant effect op de stabiliteit van de eiwitstructuur, en daarmee op de stabiliteit en activiteit van het enzymmolecuul. De resultaten toonden aan dat het enzym minder stabiel was onder zure omstandigheden, terwijl het een betere stabiliteit vertoonde bij hogere pH-waarden (neutraal en alkalisch gebied). Bij pH-waarden van 7,0, 6,0, 4,0 en 3,0 waren de enzymretentiepercentages na 120 minuten respectievelijk ongeveer 100%, 62,54%, 52,39% en 11,14% (Fig. 3b). *Strombus multisus* WRF03-laccase vertoonde een hogere stabiliteit bij neutrale pH-waarden (5,5-6,5) en een lagere stabiliteit bij zure pH-waarden (lager dan 4,0). Na 120 minuten bij pH-waarden van 5,5, 6,0 en 6,5 bedroegen de enzymretentiepercentages respectievelijk ongeveer 82%, 100% en 93%.33Khairin et al.42merkte op dat laccase van Trametes polyzona WR710-1 stabiel was in het pH-bereik van 6,0 tot 7,0, terwijl Sayed et al.45Uit onderzoek bleek dat laccase stabieler was onder neutrale pH-omstandigheden. Laccase van Cerrena unicolor vertoonde echter ook stabiliteit onder alkalische omstandigheden (pH 9,0).46De onderzochte laccasen vertoonden een hoge stabiliteit over een breed pH-bereik. Dit kan een belangrijke eigenschap zijn voor industriële toepassingen.
Omdat sommige metaalionen zowel stimulerende als remmende effecten hebben op de enzymactiviteit, moet bij industriële toepassingen rekening worden gehouden met hun invloed op de enzymactiviteit. Dit is cruciaal, omdat metaalionen veelvoorkomende milieuverontreinigingen zijn die de stabiliteit en synthese van extracellulaire enzymen kunnen beïnvloeden.47Om de effecten van meerdere metaalionen op laccase van *Pleurotus ostreatus* NRC 620 te onderzoeken, hebben we overeenkomstige experimenten uitgevoerd. Zoals weergegeven in Figuur 4, had een verhoging van de metaalionconcentratie van 2,5 mM tot 10 mM, afhankelijk van het gebruikte metaal, een negatief effect op de enzymfunctie. Bijvoorbeeld:Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, EnCu²⁺zou de enzymactiviteit kunnen stimuleren en activeren, terwijlNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, EnK⁺zouden de enzymactiviteit kunnen remmen. Bij een concentratie van 10 mM waren Cu²⁺- en Mg²⁺-ionen de krachtigste activatoren van de laccase-activiteit van *Pleurotus ostreatus* NRC 620, met een activeringsgraad van respectievelijk ongeveer 34% en 20%. Bij een concentratie van 10 mM waren Ca²⁺-ionen echter de krachtigste remmer van laccase, waardoor de enzymactiviteit met ongeveer 60% afnam.
Het effect van metaalionen op de activiteit van Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase. De laccase werd gedurende 10 minuten geïncubeerd in natriumfosfaatbuffer (0,05 M, pH 7,0) met verschillende metaalionen in concentraties van 2,5 mM en 10 mM. De reactie werd vervolgens geïnitieerd door toevoeging van het substraat (ABTS), waarna de relatieve activiteit werd gemeten.
Onze resultaten komen overeen met die van andere auteurs die hebben vastgesteld dat Mg²⁺ en Cu²⁺ de activiteit van *Trametes polyzona* WRF03³ versterken. Castaño et al.⁴⁸ ontdekten dat laccase van *Xylaria* sp. tot op zekere hoogte wordt gestimuleerd door koperionen (Cu²⁺). Bovendien voerden Foroutanfar et al.⁴⁹ en Si et al.⁵⁰ vergelijkbare studies uit naar laccases van respectievelijk *Paraconiothyrium variabile* en *Trametes pubescens*. De type II koperbindende site (T2) van dit enzym kan bij een bepaalde concentratie verzadigd raken met Cu²⁺, wat de stimulatie van de laccase-activiteit bij hogere Cu²⁺³⁹-concentraties zou kunnen verklaren. Omdat laccasen van witrotzwammen oxidases zijn die meerdere koperatomen bevatten, zijn de effecten van koperionen op de laccase-activiteit divers en variëren ze van stimulerend en remmend tot neutraal.⁵¹ Daarentegen hebben Zhou et al[52]meldde datCu²⁺remde de laccase-activiteit van de Taiwanese ondergrondse termiet (Odontotermes formosanus). De laccases van Cerena sp. HYB07 werden echter geremd.[53]en Clitocybe maxima[54]werden niet beïnvloed door koperionen.
De substraatspecificiteit werd weergegeven door de kinetische parameters (Km en Vmax); hoe sterker de bindingsaffiniteit van het substraat aan het enzym, hoe lager de Km-waarde en hoe hoger de substraatspecificiteit.3,21,55De kinetische parameters (Km en Vmax) van laccase uit *Pleurotus ostreatus* NRC 620 werden bepaald met behulp van GraphPad Prism 6.0-software door middel van een Lineweaver-Burk-grafiek (Figuur 5). Bij gebruik van ABTS als substraat waren de resultaten 1,99 mM en 16217 μmol.min⁻¹ L⁻¹,respectievelijk. Elsayed et al.21Er werd gerapporteerd dat de Km-waarden voor ABTS-oxidatie respectievelijk 0,1 mM en 0,064 mM bedroegen, wat wijst op een hoge affiniteit van de Lac A- en Lac B-iso-enzymen voor ABTS. Bovendien bedroegen de Vmax-waarden 0,182 μmol.min⁻¹en 0,603 μmolmin⁻¹respectievelijk. De verkregen Km-waarde was lager dan die van Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); bovendien was hun Vmax-waarde (1429 mmol min⁻¹) ooklagerbij gebruik van ABTS als substraat.33 Op dezelfde manier waren de Km-waarden van de laccaseconcentraties van Lentinus squarrosulus MR13 en Trametes sp. AH28-2 respectievelijk 0,0714 mM en 0,025 mM, en de Vmax-waarden waren 0,0091 mM min−1 en 0,67 mM min−1 mg−1 (ten opzichte van ABTS).respectievelijk.56,57
Het effect van de ABTS-concentratie op de activiteit van laccase van *Pleurotus ostreatus* NRC 620 werd onderzocht en er werd een Lineweaver-Burk-grafiek gemaakt van het omgekeerde van de initiële reactiesnelheid versus de ABTS-concentratie. De oxidatiereactie van ABTS met verschillende concentraties (0,025–3,0 mM) laccase werd gemeten bij pH 4,5 om de kinetische parameters (Vmax en Km) te bepalen. De Michaelis-Menten kinetische constanten werden berekend met behulp van de Lineweaver-Burk-grafiek van het omgekeerde van de reactiesnelheid versus de substraatconcentratie. De kinetische constanten werden berekend uit de Lineweaver-Burk-grafiek met behulp van GraphPad Prism 6.01-software.
Traditionele klaringsenzymen, zoals pectinases, hydrolyseren pectineachtige stoffen, waardoor de viscositeit en troebelheid afnemen. Ze breken structurele polysacchariden effectief af en worden vaak gebruikt in combinatie met andere enzymen, zoals cellulases en hemicellulases, om de opbrengst en helderheid te verbeteren. Pectinases richten zich echter niet specifiek op fenolische verbindingen, die de belangrijkste oorzaak zijn van troebelheid en oxidatieve bruining, met name in sappen zoals appel- en druivensap.58Laccases katalyseren daarentegen de oxidatie van fenolische verbindingen, waardoor deze polymeriseren tot grotere, onoplosbare moleculen die door sedimentatie of filtratie kunnen worden verwijderd. Dit mechanisme verbetert niet alleen de helderheid, maar verlengt ook de houdbaarheid van sap door de kans op oxidatieve bruining, veroorzaakt door fenolische verbindingen, te verkleinen. Bovendien kunnen op laccase gebaseerde klaringsprocessen worden uitgevoerd onder milde verwerkingsomstandigheden (pH 3,5–5,5, temperatuur 25–40 °C), waardoor ze geschikt zijn voor delicate sappen zonder dat hun nutritionele of organoleptische eigenschappen worden aangetast.59Onderzoek heeft aangetoond dat behandeling met pectinase sap binnen 1-2 uur kan klaren, terwijl behandeling met laccase doorgaans een langere reactietijd (3-6 uur) vereist om fenolische verbindingen volledig te reduceren. Dit proces kan echter worden geoptimaliseerd door het enzym te immobiliseren of door laccase te combineren met mechanische klaringsmethoden.60In deze studie toonde enzymprofilering van het ruwe extract significante laccase- en α-amylase-activiteiten aan, terwijl de pectinase- en xylanase-activiteiten extreem laag waren en er geen cellulase-activiteit werd gedetecteerd. De afname van de troebelheid en het fenolgehalte was daarom voornamelijk te danken aan de werking van laccase, terwijl de verandering in viscositeit gedeeltelijk toe te schrijven zou kunnen zijn aan de werking van amylase.
Tabel 1 toont de fysisch-chemische parameters van vers geperst appelsap en met laccase behandelde monsters. De resultaten laten zien dat de opbrengst van vers geperst appelsap (71,59%) lager was dan die van met laccase behandelde monsters (87,34%). Deze resultaten komen overeen met de bevindingen van Pilnik en Orange.61die aangaven dat het gebruik van enzymen bij de fruitverwerking de sapopbrengst kan verhogen, de filtratie kan verbeteren en kan leiden tot helder sap van hoge kwaliteit voor concentratie. De toename van de sapopbrengst is voornamelijk te danken aan de toename van het gehalte aan oplosbare suikers in het sap. Tijdens de enzymatische hydrolyse van fruit worden mesoglea en pectine in de celwanden van het product afgebroken en omgezet in oplosbare stoffen zoals neutrale suikers en zuren.62.De pH-waarde van het met enzymen behandelde appelsap was significant lager dan die van de controlegroep (P < 0,05), en de pH-waarde van beide groepen nam significant toe tijdens de opslag (Tabel 1). Deze resultaten komen overeen met die van Mark et al.63die opmerkten dat de pH van cashewnotensap na opslag na warmtebehandeling daalde. De afbraak van pectine en de vorming van galacturonzuur na enzymbehandeling zouden verantwoordelijk kunnen zijn voor de pH-stijging tijdens opslag. De pH van de met enzymen behandelde monsters bleef gedurende de gehele opslagperiode tussen 4,05 en 4,31, terwijl de pH van onbehandeld appelsap tussen 4,12 en 4,33 lag.
De totale zuurgraad (TA) van zowel onbehandelde als met laccase behandelde monsters vertoonde een dalende trend naarmate de bewaartijd toenam (Tabel 1). De afname van de zuurgraad werd toegeschreven aan de omzetting van organische zuren in koolhydraten of enzymatische reacties, evenals oxidatie tijdens de opslag van het sap.64De totale zuurgraad van het controle-appelsap en de met enzymen behandelde monsters was lager dan die van andere sappen (aardbeiensap 0,9%, pruimensap 2,2%, kumquatsap 1,0%, abrikozensap 2,4%, sinaasappelsap 0,8%), maar vergelijkbaar met die van andere sappen (bijv. perensap 0,3%).62Deze verschillen in onbehandeld, vers geperst appelsap kunnen te wijten zijn aan diverse factoren, zoals groeiomstandigheden, genetische factoren, rijpheid en verwerkingsmethoden.65De afname van de totale zuurgraad van het controle-appelsap en het met laccase behandelde appelsap komt overeen met de resultaten die door Singh et al. zijn gepresenteerd.66met betrekking tot de afname van de totale zuurgraad van Jin Nuo-appelsap na 74 dagen opslag. Aan de andere kant stellen Oshmiansky en Wojdylo67Er werden geen significante veranderingen in de zuurgraad van appelsap gevonden bij het bestuderen van het effect van traditionele klaringsmethoden.
De resultaten in tabel 1 tonen aan dat de waarde van de totale oplosbare vaste stoffen (TSS) van het met laccase behandelde appelsap hoger was dan die van het onbehandelde monster. Deze resultaten komen overeen met gepubliceerde studies.. 68Tabel 1 laat bovendien zien dat de TSS-waarde van de controlegroep appelsap 9,58 bedroeg op het beginmoment en 11,05 bereikte aan het einde van de bewaarperiode. Deze waarden zijn lager dan de TSS-waarden van vers appelsap die door Hamid et al. zijn gerapporteerd.. 69(respectievelijk 11,2 en 11,80). De TSS-waarde van de met laccase behandelde appelsapmonsters nam significant toe, beginnend bij 11,23 en oplopend tot 12,93 na twee weken opslag bij 4 °C (Tabel 1). Een vergelijkbare toename van TSS tijdens opslag werd ook waargenomen bij citrusvruchten, citroenen en zoete sinaasappels. De toename van de totale oplosbare vaste stoffen (TSS) tijdens opslag kan te wijten zijn aan de hydrolyse van polysacchariden (zetmeel) tot monosacchariden (suikers), de toename van de concentratie als gevolg van dehydratatie van het sap en de afbraak van pectine in het sap tot oplosbare vaste stoffen. De toename van de totale oplosbare vaste stoffen (TSS) is waarschijnlijk te wijten aan de toename van oplosbare suikers, die gevormd kunnen worden door de omzetting van pectine of cellulose in oplosbare suikers door respectievelijk pectine of cellulase, of door de hydrolyse van zetmeel tot suikers, zoals gerapporteerd door Hamed et al.69.Het effect van laccase op de eigenschappen van appelsap is visueel waarneembaar, aangezien met laccase behandeld appelsap een betere vloeibaarheid en een lagere viscositeit vertoont dan onbehandeld sap. Deze waarneming is weergegeven in Tabel 1; de viscositeit van het met enzym behandelde monster was 1,87 cP, terwijl de viscositeit van het controlemmonster 2,95 cP was. Deze significante afname van de viscositeit is waarschijnlijk te danken aan het hogere waterbindend vermogen van pectine-achtige stoffen en de vorming van een samenhangende netwerkstructuur.
In deze studie werd het effect van laccase op de bruiningsindex (BI) van appelsap onderzocht door de absorptie bij 420 nm te meten met een spectrofotometer. De resultaten worden weergegeven in Tabel 1. Tijdens de opslag vertoonde de BI van de appelsapmonsters in zowel de behandelde als de onbehandelde groep een geleidelijk stijgende trend. De BI weerspiegelt de mate van bruining en kan dienen alseen belangrijkindicator van enzymatische en niet-enzymatische bruiningsreacties. De absorptie nam significant toe tijdens opslag (P < 0,05). Aan het einde van de opslagperiode, deA420De waarde van de appelsapmonsters in de controle- en de enzymbehandelde groep nam respectievelijk met ongeveer 217% en 121% toe (Tabel 1). De resultaten geven aan dat enzymbehandeling de bruiningsgraad effectief met ongeveer 56% kan verminderen. De resultaten van Bezerra et al.[19] komen overeen met onze resultaten; zij gebruikten laccase-glutaraldehyde-kokosvezel om appelsap te klaren, waardoor de oorspronkelijke kleur met 61% afnam.
Hoewel polyfenolen in vruchtensappen positieve nutritionele en therapeutische effecten hebben op het menselijk lichaam, kunnen ze ook reageren met eiwitten, waardoor het sap troebel wordt, bezinkt of ondoorzichtig wordt. Dit verandert de smaak en het aroma van het product en verkort de houdbaarheid.71Het doel van deze studie was om het gehalte aan fenolische verbindingen in appelsap op een veilige manier te verlagen met behulp van laccase van Pleurotus ostreatus NRC 620. De resultaten in Tabel 1 laten zien dat het totale gehalte aan fenolische verbindingen in met laccase behandeld appelsap significant was verlaagd vóór opslag bij 4 °C. Bovendien nam het totale gehalte aan fenolische verbindingen ook af tijdens opslag in beide onderzochte monsters (Tabel 1). Onderzoek van Sandri et al.72Uit onderzoek is gebleken dat met enzymen behandeld appelsap zijn antioxiderende werking en het gehalte aan fenolische verbindingen kan behouden. De resultaten van een studie van Lettera et al. laten echter iets anders zien.73Uit onderzoek blijkt dat behandeling van sinaasappelsap met schimmellaccase het gehalte aan fenolische verbindingen erin met wel 45% kan verlagen.
Het is aangetoond dat fenolische verbindingen eigenschappen bezitten zoals het wegvangen van vrije radicalen, het reduceren en neutraliseren van singletzuurstof, het overdragen van waterstofatomen en het doneren van elektronen aan vrije radicalen, waardoor ze krachtige antioxidanten zijn.74Daarom werden in deze studie DPPH- en FRAP-gebaseerde methoden gebruikt om het effect van laccase op de antioxidantactiviteit van appelsap te evalueren dat gedurende 14 dagen in de koelkast werd bewaard (Tabel 2). Beide methoden toonden een toename van de antioxidantactiviteit tijdens de bewaring aan, wat mogelijk te wijten is aan de toename van vrije fenolische verbindingen of de vorming van Maillard-reactieproducten (MRP's), waarbij de Maillard-reactieproducten waarschijnlijk de oorzaak zijn van de toename in antioxidantactiviteit.75Niet-enzymatische bruiningsreacties (waaronder de afbraak van ascorbinezuur, Maillardreacties en zuurgekatalyseerde afbraak van suikers) produceren bruine pigmenten (melanoidinen). Tussenproducten van de afbraak van ascorbinezuur en suikers (zoals carbonylverbindingen) kunnen via Maillardreacties reageren met aminozuren.76Hoewel het bruin worden van groenten en fruit tijdens de opslag uitgebreid is onderzocht, is onze kennis van deze reacties nog beperkt.77Vergeleken met de FRAP-methode vertoonde met laccase behandeld appelsap een significant lagere antioxidantactiviteit volgens de DPPH-methode (Tabel 2), en de antioxidantactiviteit van alle monsters nam significant toe met toenemende bewaartijd. In deze studie werden twee verschillende methoden gebruikt om de antioxidantactiviteit te bepalen, omdat hun principes verschillen. De DPPH-methode meet het vermogen om vrije radicalen te neutraliseren, terwijl de FRAP-methode het vermogen meet om ijzerionen te reduceren. Daarom wordt aanbevolen om meerdere methoden te gebruiken voor het bepalen van de antioxidantactiviteit om de antioxidantactiviteit van de onderzochte monsters beter te begrijpen.78
Een van de belangrijkste bevindingen van dit onderzoek is dat de laccase NRC 620 van *Pleurotus ostreatus* optimale activiteit vertoont bij 70 °C en pH 3,0. In vergelijking met andere laccases van schimmels die vaak worden gebruikt voor sapklaring, zoals de laccases van *Trametes versicolor* en *Ganoderma lucidum*, vertoont *P. ostreatus* NRC 620 een hogere thermische stabiliteit en een zuurdere pH. Laccases van *Trametes versicolor* en *Ganoderma lucidum* vertonen doorgaans optimale activiteit in het temperatuurbereik van 50-60 °C en bij pH-waarden tussen 3,5 en 5,0. Dit verschil kan bijdragen aan een verbeterde efficiëntie van de sapklaring, met name voor zure sappen waar stabiliteit bij lagere pH-waarden cruciaal is. De unieke eigenschap van *P. ostreatus* NRC 620 ten opzichte van andere onderzochte laccases van schimmels is dat het effectief functioneert onder meer uitdagende omstandigheden. De hogere optimale activiteitstemperatuur suggereert potentiële voordelen in industriële toepassingen, zoals snellere reactiesnelheden en verminderde microbiële besmetting. De lage pH, die goed aansluit bij de zure aard van veel sappen, kan nuttig zijn bij sapklaringsprocessen. Deze resultaten rechtvaardigen verder onderzoek naar grootschalige toepassing, waardoor *Pleurotus ostreatus* NRC 620 een levensvatbaar alternatief is voor traditionele schimmellaccasebronnen. In vergelijking met eerdere studies vonden we dat de optimale temperatuur 60 °C is en de optimale pH 3,0. Na een reactie van 80 minuten bij 60 °C bleef de laccase van *Ganoderma lucidum* behouden.46% van zijn activiteit.79 Volgens Kurniawati en Nicelle80De enzymen van *Ganoderma lucidum* vertonen een uitstekende tot matige stabiliteit bij 25 °C en pH-waarden van 5,0 tot 8,0, en stabiliteit bij pH 6,0 en temperaturen van 10 tot 30 °C. In deze studie vonden we dat de optimale pH en temperatuur voor de enzymactiviteit van *Pleurotus ostreatus* respectievelijk 3,0 en 70 °C waren. Na incubatie bij 40 °C en 50 °C gedurende twee uur behield het enzym respectievelijk 68,33% en 59,61% van zijn activiteit. Bovendien vertoonde de Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase een hoge activiteit over een breed temperatuurbereik van 50 °C tot 80 °C, waarbij de activiteit bijna het maximum bereikte (69%-98%), met een maximum bij 70 °C.
Samenvattend vertoonde oesterzwamlaccase NRC620, verkregen onder statische omstandigheden, optimale activiteit en stabiliteit over een breed scala aan pH- en temperatuuromstandigheden, en een superieure stabiliteit in vergelijking met andere enzymbronnen. De toevoeging van 10 mM MgSO₄ en CuSO₄ verhoogde de enzymactiviteit met respectievelijk ongeveer 21% en 35%. Bij verwerking tot appelsap verlaagde het enzym de pH en de viscositeit, terwijl het fenolgehalte tijdens opslag slechts licht afnam.
De resultaten bevestigen het potentieel van laccase in de voedingsmiddelenindustrie, met name voor het klaren van dranken. Door specifiek fenolische verbindingen af te breken, vermindert laccase niet alleen de troebelheid en verbetert het de helderheid, maar behoudt het ook de kwaliteit van vruchtensappen onder milde bedrijfsomstandigheden. In tegenstelling tot traditionele klaringsmiddelen zoals gelatine, bentoniet en silicagel, produceert laccase geen afval en verwijdert het geen aangename aroma's uit dranken, waardoor het een milieuvriendelijkere en duurzamere optie is. Bovendien biedt laccase, vergeleken met andere enzymen en filtratiemethoden, een gerichte en kosteneffectieve oplossing zonder afbreuk te doen aan de productkwaliteit.
Kyomuhimbo, HD en Brink, HG. Toepassingen en immobilisatiestrategieën van koperhoudende laccasen; een overzicht. Heliyon 9, e13156 (2023).
Geplaatst op: 15 december 2025